Secreción pulsátil diurna de la hormona foliculo estimulante (FSH) en ovejas prepúberes con y sin restriccion alimenticia (página 2)

4. Material y metodos

Manejo general de
las ovejas prepúberes. Se
utilizaron 10 borregas de raza Suffolk provenientes de la Unidad
de Producción Ovina de la Facultad de
Agronomía de la Universidad de
Concepción, nacidas a fines de agosto y destetadas a los 3
meses de edad. A su llegada a la Facultad de Medicina
Veterinaria se
alimentaron con pradera y alimento concentrado peletizado
(Novillina Champion®). A las 20 semanas de edad, las borregas
se separaron al azar en 2 grupos: un
grupo control y uno
experimental. Con el fin de controlar la alimentación, las
borregas se mantuvieron estabuladas y recibieron solo alimento
concentrado. Las borregas del grupo control (n=5) recibieron
alimento a voluntad, mientras que las borregas del grupo
experimental (n=5) recibieron alimento concentrado en cantidad
equivalente al 2% del peso corporal. Ambos grupos recibieron dos
raciones al día. Con este esquema de alimentación
se buscó mantener el peso en las borregas del grupo
experimental durante el período de restricción
alimenticia. Tres días antes de los estudios de
pulsatilidad de FSH, las borregas se trasladaron a la sala de
experimentación, donde se colocaron en bretes
individuales, manteniéndose el régimen de
alimentación y con libre acceso a agua. Las
borregas se cateterizaron en la vena yugular de acuerdo al
procedimiento
descrito por Recabarren y col. (1995). Se procedió a
realizar muestreos sanguíneos de acostumbramiento
siguiendo el mismo protocolo del
estudio de pulsatilidad por una hora, dos veces al día, el
día anterior al inicio del experimento, con el fin de
minimizar los riesgos de
estrés.

Estudio de pulsatilidad
de FSH. El estudio de pulsatilidad de FSH
consistió en la colección de muestras de sangre (3 mL) por
medio del catéter yugular implantado previamente, a
intervalos de 10 minutos por un período de 5 horas (10:00-
15:00 horas) a las 20, 26 y 30 semanas de edad, después de
0. 6 y 10 semanas de restricción alimenticia del grupo
experimental. Las muestras de sangre se depositaron en tubos
heparinizados (10 UI de heparina/mL de sangre), se centrifugaron
a 1000 x g, por 15 minutos, el plasma se separó y se
congeló a –20°C, hasta el posterior análisis de las concentraciones
plasmáticas de FSH por radioinmunoensayo (RIA).

Radioinmunoensayo de FSH. El
radioimmunoensayo de FSH se realizó con materiales
provenientes de la NIADDK (USA) siguiendo el protocolo indicado
con los materiales. Brevemente, se incubaron 200 µl de FSH
ovina standard (oFSHRP) en un rango de 0.02 a 25.6 ng/tubo o 200
µl de muestra
desconocida, con 100 µL de FSH iodada (oFSH I-1 AFP 5679 C)
y 100 µL de antisuero contra FSH ovina (AFP C 5228113) por
24 horas a temperatura
ambiente.
Luego, se agregaron 100 µL de segundo anticuerpo y se
continuó la incubación por 48 horas.
Posteriormente, los tubos se centrifugaron a 1000 x g por 40 min
a 4º C, se descartó el sobrenadante y se
cuantificó el pellet en un gammaespectrómetro LKB.
La concentración mínina detectable correspondiente
al 90% del buffer control fue de 0.2 ng/mL., con un coeficiente
de variación intraensayo de 6% e interensayo de
10%.

Determinación de las
características de la
secreción pulsátil de
FSH. Las concentraciones plasmáticas de FSH de
cada oveja se analizaron en forma individual usando el programa
computacional CLUSTER, desarrollado por Veldhuis y Johnson
(1986). Este programa permite identificar, mediante un algoritmo
reiterativo, las fluctuaciones hormonales definidas como pulsos
en una serie consecutiva de muestras, utilizando como
parámetro de identificación el coeficiente de
variación del RIA, la frecuencia de muestreo, la
forma definida del pulso asignada por el operador (usando 1 o
más puntos para el "peak" y uno o más puntos para
el nadir), y las diferencias estadísticas entre puntos. El programa
además identifica la amplitud media de los pulsos, el
intervalo entre pulsos, la duración de los pulsos y el
nadir (promedio de las concentraciones plasmáticas entre
los pulsos). Para la identificación de los pulsos de FSH
se escogió una forma de pulso de 3×3 para definir el
máximo y el mínimo respectivamente con un test de t de 2.75
(). Con este procedimiento las
probabilidades de identificar un pulso falso positivo fue menor
de 5%.

Análisis estadístico.
Los parámetros de la secreción pulsátil de
FSH: promedio transversal del período (ng/mL/5h),
frecuencia de pulsos (número de pulsos/5h), amplitud de
los pulsos (ng/mL) y nadir (ng/mL) presentes a las 20, 26 y 30
semanas se analizaron en un mismo grupo mediante análisis
de varianza para muestras repetidas en un diseño
de bloques, con comparación entre los promedios con el
test de Newman Keuls utilizando el programa estadístico
GB.Stat v.6. Los datos se muestran
como promedio ± error estándar. Se consideró
un P<0.05 como una diferencia estadísticamente
significativa.

5. Resultados

En el
cuadro 1 se entregan los resultados del
estudio de pulsatilidad de FSH en las borregas controles y en las
borregas con restricción alimenticia. El promedio
transversal de la concentración de FSH (ng/mL/5h)
aumentó cerca de un 50% entre las 20 y las 30 semanas de
edad en el grupo de borregas controles (P>0.05). En cambio, en las
borregas sometidas a restricción alimenticia se
observó una tendencia a disminuir entre las 20 y las 30
semanas de edad, al cabo de 10 semanas de restricción. La
concentración plasmática promedio de FSH (ng/mL/5h)
en el grupo de borregas experimentales fue menor en más de
un 50% en comparación con las concentraciones
plasmáticas de FSH de las borregas controles
(P>0.05).

Como se muestra en el cuadro 1, la frecuencia de los
pulsos de FSH no presentó diferencias estadísticas
entre las edades en un mismo grupo ni entre los grupos. La
amplitud de los pulsos de FSH tendió a aumentar entre las
20 y 30 semanas de edad en el grupo control, con una
disminución mayor de un 50% en las borregas con
alimentación restringida entre las 20 y 30 semanas de edad
(P>0.05). La amplitud de los pulsos tendió a ser menor
en las borregas con restricción alimenticia que en el
grupo control a las 30 semanas de edad (P=0.079), luego de 10
semanas de restricción alimenticia.

El nadir disminuyó en un 50% luego de 10 semanas
de restricción alimenticia en las borregas con
restricción alimenticia, pero sin significancia estadística entre las edades ni entre los
dos grupos de borregas.

Con relación a los perfiles de las
concentraciones plasmáticas de FSH de cada borrega, en las
borregas controles, a las 30 semanas de edad, con
excepción de una borrega, se observa que la
secreción pulsátil de FSH se ha acentuado con
respecto a las 20 y 26 semanas de edad (figura
1). Por el contrario, en las borregas con
alimentación restringida, la pulsatilidad de la
secreción de FSH está disminuida en
comparación con las borregas controles de la misma edad
(figura
2).

6. Discusion

Se ha postulado que la restricción alimenticia
retrasa el inicio de la pubertad en
borregas, lo cual se debería a una menor secreción
de GnRH, asociada a una menor secreción de LH. El objetivo de
este estudio fue reconocer si la restricción alimenticia
podría influir también en la secreción de
FSH, teniendo presente que la FSH así como la LH se
secreta desde la hipófisis en respuesta a la
GnRH.

Los resultados obtenidos en el presente estudio muestran
que las concentraciones plasmáticas promedio, la
frecuencia, la amplitud de los pulsos y el nadir de FSH tienden a
aumentar entre las 20 y 30 semanas de edad en las borregas
controles. Estos resultados concuerdan con los obtenidos
por
Padmanabhan y col. (1992), quienes
encontraron que la concentración plasmática de FSH
immunoreactiva de borregas prepúberes y púberes no
presenta diferencias, aunque la FSH bioactiva aumenta. Estos
autores demostraron también que en las hembras
púberes hubo un aumento de la inhibina y del estradiol
plasmático (Padmanabhan
y col., 1992). En contraste con lo observado en
las borregas controles, en las borregas con restricción
alimenticia la concentración promedio y la amplitud de los
pulsos de FSH tienden a disminuir entre las 20 y las 30 semanas
de edad, luego de 10 semanas de restricción alimenticia,
aunque sin cambios en la frecuencia de pulsos de FSH. Estos
resultados concuerdan también con la demostración
que la restricción proteica durante el desarrollo
prepuberal de ovejas tampoco influye en la síntesis
de FSH, pero sí lo hace sobre la síntesis de LH
(Polkowska
y col., 2003). Estos resultados sugieren que la
restricción alimenticia tendría un efecto supresor
parcial sobre la secreción de FSH, de tal forma que el
retraso en el inicio de los ciclos estrales en borregas con
restricción alimenticia sería consecuencia de otros
mecanismos en los cuales no estaría comprometida la
secreción de FSH, y si lo fuese, la FSH no sería un
factor determinante en este fenómeno.

Los resultados del presente trabajo
concuerdan con los descritos en un estudio realizado en vaquillas
con restricción alimenticia. En este estudio se
encontró que las vaquillas exhibieron menor
secreción de LH como consecuencia de una
disminución en la producción y secreción de
GnRH, pero sin cambios en la secreción de FSH
(Viscarra
y col., 1997). Para estos investigadores, la FSH
no es esencial en los eventos que
conducen al inicio de la reproducción en la vaca, ya que sus
concentraciones plasmáticas no se modificaron con la
restricción alimenticia. Es posible entonces que en la
borrega ocurra algo similar a lo descrito en vaquillas, ya que en
un estudio complementario al presente trabajo, en el cual se
midió la concentración plasmática de LH
(Recabarren
y col., 2001), se demostró que la
restricción alimenticia postergó el inicio de la
pubertad acompañada con una disminución
significativa en la secreción de LH. Este concepto es
respaldado por el hecho de que en las borregas controles hubo una
tendencia a que la secreción de FSH aumentara entre las 20
y 30 semanas de edad. Por consiguiente, estos datos
colectivamente sugieren que la secreción de LH es
más decisiva en los eventos que anteceden a la pubertad,
independiente del hecho de que ambas gonadotropinas dependen de
la GnRH para su secreción. Una situación similar se
ha reconocido en machos. En carneros Merino adultos castrados con
sustitución de testosterona y de inhibina, alimentados a
la mitad de una dieta de mantención, no mostraron
diferencias en la secreción de FSH con respecto a machos
alimentados con dieta de mantención (Tjondronegoro
y col., 1996), resultados que confirman la
hipótesis de que la nutrición ejerce
escasa influencia sobre la secreción de FSH.

De acuerdo a los estudios de
Wildt y col. (1981), la frecuencia de
pulsos de GnRH determina el tipo de gonadotropina que secreta la
hipófisis. Altas frecuencias de pulsos de GnRH favorecen
la secreción de LH y reducen la secreción de FSH,
mientras que bajas frecuencias de pulsos de GnRH disminuyen la
secreción de LH, pero facilitan la secreción de
FSH. En el presente estudio, es posible suponer que la
restricción alimenticia disminuyó la
secreción pulsátil de GnRH. Esto es posible
deducirlo por medio del análisis de las
características de la secreción pulsátil de
LH, ya que hay una estrecha asociación entre la
secreción de GnRH y LH. Sin embargo, en el estudio
paralelo a éste y que se ocupó del análisis
de la secreción de LH (e indirectamente de la
secreción de GnRH por la estrecha dependencia entre ambas
hormonas) en
borregas con restricción alimenticia, no se observaron
cambios en la frecuencia de pulsos de LH, por lo que se puede
asumir que la frecuencia de pulsos de GnRH no se modificó,
pero sí hubo una disminución significativa en la
concentración plasmática de LH y en la amplitud de
los pulsos. Esto podría explicar en parte la parcialidad
del efecto de la restricción alimenticia sobre la
secreción de FSH, ya que si hubiese habido una
disminución en la frecuencia de los pulsos de GnRH,
debería haber aumentado la secreción de FSH. Es
posible entonces suponer que la restricción alimenticia
podría estar influyendo en la secreción de FSH
mediante otros mecanismos no dependientes de la GnRH.

Otros importantes reguladores de la secreción de
FSH en hembras son las inhibinas, activinas y foliculostatinas
(Welt,
2002). Se desconoce si en la oveja
prepúber la restricción alimenticia podría
influir en la secreción de inhibina, o en la
concentración de activinas o en la actividad de la
foliculostatina lo que podría explicar la
disminución en las concentraciones plasmáticas de
FSH. Se ha demostrado que ovejas Merino delgadas tienen mayor
cantidad de inhibina en los ovarios que ovejas obesas
(Boukhliq
y col., 1996), por lo que se podría
especular que las borregas con bajo peso corporal, producto de la
restricción alimenticia, podrían sintetizar y
secretar mayores cantidades de inhibina que las borregas con
crecimiento normal y contribuir al control de la secreción
de FSH. En carneros, alimentados con la mitad de la dieta de
mantención, la
administración de líquido folicular bovino
disminuyó en mayor proporción la FSH
plasmática que en carneros alimentados con el doble de la
dieta de mantención (Tjondronegoro
y col., 1996), lo que sugeriría que los
carneros sub-alimentados serían más sensibles al
efecto inhibidor de la inhibina. Sin embargo, el efecto de la
sub-alimentación sobre la producción de inhibina en
borregas tampoco sería muy destacable, de lo contrario se
debería haber observado una importante disminución
de la secreción de FSH al sumarse los efectos
hipotalámicos y los de origen ovárico sobre la
secreción de FSH.

En resumen, las concentraciones plasmáticas de
FSH no aumentan significativamente entre las 20 y 30 semanas de
edad en borregas con un régimen de alimentación
normal, mientras que en borregas con restricción
alimenticia la FSH plasmática tiende a disminuir. Los
resultados sugieren que la restricción alimenticia
tendría un efecto supresor parcial sobre la
secreción de FSH, de tal forma que el retraso en el inicio
de los ciclos estrales en borregas con restricción
alimenticia sería consecuencia de otros mecanismos en los
cuales no estaría comprometida la secreción de FSH,
o si lo fuese, la FSH no sería un determinante en este
fenómeno.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la NIADDK y al Dr A. Parlow por
su generosa entrega de reactivos para el RIA de FSH. Al Dr
José Cox por facilitarnos la sala de
experimentación.

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